जीन क्लोनिंग

जीन क्लोनिंग-

आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीकों का उपयोग करके किसी विशेष जीन या डीएनए अनुक्रम की सटीक प्रतियों का उत्पादन जीन क्लोनिंग कहलाता है।शब्द "जीन क्लोनिंग," "डीएनए क्लोनिंग," "आणविक क्लोनिंग," और "पुनः संयोजक डीएनए तकनीक" सभी एक ही तकनीक को संदर्भित करते हैं।जब किसी जीव से डीएनए निकाला जाता है, तो उसके सभी जीन प्राप्त हो जाते हैं। जीन (डीएनए) में एक विशेष जीन क्लोनिंग की नकल करके "क्लोन" बनाया जाता है।क्लोनिंग एक ऐसी विधि है जिसका उपयोग रुचि के जीन के अलगाव और प्रवर्धन के लिए किया जाता है।

डीएनए क्लोनिंग दो अलग-अलग तरीकों से हासिल की जा सकती है:

सेल आधारित डीएनए क्लोनिंगसेल-फ्री डीएनए क्लोनिंग (पीसीआर)

जीन क्लोनिंग के लिए आवश्यकताएँ (सेल-आधारित)

क्लोन किए जाने वाले वांछित जीन युक्त डीएनए खंड ।प्रतिबंध एंजाइम और लिगेज एंजाइम ।वेक्टर - मेजबान सेल में क्लोन जीन को ले जाने, बनाए रखने और दोहराने के लिए।मेजबान कोशिका - जिसमें पुनः संयोजक डीएनए दोहरा सकता है।

जीन क्लोनिंग का सिद्धांत

डीएनए का एक टुकड़ा, जिसमें क्लोन किया जाने वाला जीन होता है, एक पुनः संयोजक डीएनए अणु का उत्पादन करने के लिए एक उपयुक्त वेक्टर में डाला जाता है। वेक्टर एक वाहन के रूप में कार्य करता है जो जीन को एक मेजबान सेल में आमतौर पर एक जीवाणु में स्थानांतरित करता है, हालांकि अन्य प्रकार के जीवित सेल का उपयोग किया जा सकता है। मेजबान सेल के भीतर वेक्टर गुणा करता है, न केवल स्वयं की बल्कि जीन की भी कई समान प्रतियां तैयार करता है। जब परपोषी कोशिका विभाजित होती है, तो पुनः संयोजक डीएनए अणु की प्रतियां संतति को दी जाती हैं और आगे सदिश प्रतिकृति होती है। बड़ी संख्या में कोशिका विभाजन के बाद, समान मेजबान कोशिकाओं की एक कॉलोनी या क्लोन का निर्माण होता है। क्लोन में प्रत्येक कोशिका में पुनः संयोजक डीएनए अणु की एक या अधिक प्रतियां होती हैं; पुनः संयोजक अणु द्वारा वहन किए गए जीन को अब क्लोन कहा जाता है।

जीन क्लोनिंग में कदम

जीन क्लोनिंग में शामिल मूल 7 चरण हैं:

डीएनए का अलगाव [रुचि का जीन] क्लोन किए जाने वाले टुकड़े।पृथक डीएनए को पुनः संयोजक डीएनए बनाने के लिए एक उपयुक्त वेक्टर में सम्मिलित करना।मेजबान के रूप में ज्ञात एक उपयुक्त जीव में पुनः संयोजक डीएनए का परिचय।रूपांतरित मेजबान कोशिकाओं का चयन और रुचि के जीन वाले क्लोन की पहचान।मेजबान में पेश किए गए जीन का गुणन/अभिव्यक्ति।जीन द्वारा व्यक्त कई जीन प्रतियों/प्रोटीन का अलगाव।पृथक जीन प्रतिलिपि/प्रोटीन की शुद्धि

A. डीएनए के टुकड़े या जीन का अलगाव

क्लोन किए जाने वाले लक्ष्य डीएनए या जीन को पहले पृथक किया जाना चाहिए। रुचि का जीन जीन का एक टुकड़ा है जिसका उत्पाद (एक प्रोटीन, एंजाइम या एक हार्मोन) हमें रूचि देता है। उदाहरण के लिए, हार्मोन इंसुलिन के लिए जीन एन्कोडिंग।वांछित जीन को रेस्ट्रिक्शन एंडोन्यूक्लिएज (आरई) एंजाइम का उपयोग करके अलग किया जा सकता है, जो विशिष्ट मान्यता न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों में डीएनए को काटता है जिसे आंतरिक क्षेत्र (इसलिए एंडोन्यूक्लिज) की ओर प्रतिबंध साइटों के रूप में जाना जाता है, जो कुंद या चिपचिपा सिरों का उत्पादन करता है।कभी-कभी, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एंजाइम का भी उपयोग किया जा सकता है जो अपने एमआरएनए का उपयोग करके वांछित जीन के पूरक डीएनए स्ट्रैंड को संश्लेषित करता है।

बी उपयुक्त क्लोनिंग वेक्टर का चयन

वेक्टर एक वाहक अणु है जो एक मेजबान में रुचि के जीन (जीआई) को ले जा सकता है, जीआई के साथ-साथ इसकी कई प्रतियां बना सकता है।क्लोनिंग वैक्टर डालने के आकार तक सीमित हैं जो वे ले जा सकते हैं। आकार और डालने के आवेदन के आधार पर उपयुक्त वेक्टर का चयन किया जाता है।क्लोनिंग के लिए उपलब्ध विभिन्न प्रकार के वैक्टर प्लास्मिड, बैक्टीरियोफेज, बैक्टीरियल आर्टिफिशियल क्रोमोसोम (बीएसी), यीस्ट आर्टिफिशियल क्रोमोसोम (वाईएसी) और स्तनधारी कृत्रिम क्रोमोसोम (एमएसी) हैं।हालांकि, सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले क्लोनिंग वैक्टर में अन्य सभी उपलब्ध वैक्टरों के अलावा प्लास्मिड और बैक्टीरियोफेज (फेज ) शामिल हैं।

C. क्लोनिंग वैक्टर के आवश्यक लक्षण

सभी क्लोनिंग वैक्टर वाहक डीएनए अणु हैं। इन वाहक अणुओं में सामान्य रूप से कुछ सामान्य विशेषताएं होनी चाहिए जैसे:

यह मेजबान सेल के अंदर स्व-प्रतिकृति होना चाहिए।इसमें आरई एंजाइमों के लिए एक अद्वितीय प्रतिबंध स्थल होना चाहिए।दाता डीएनए खंड का परिचय वेक्टर की प्रतिकृति संपत्ति में हस्तक्षेप नहीं करना चाहिए।इसमें कुछ मार्कर जीन होना चाहिए जैसे कि इसका उपयोग पुनः संयोजक सेल (आमतौर पर एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन जो मेजबान सेल में अनुपस्थित है) की पहचान के लिए किया जा सकता है।उन्हें मेजबान सेल से आसानी से अलग किया जाना चाहिए।

डी. पुनः संयोजक डीएनए का गठन

प्लास्मिड वेक्टर को उसी आरई एंजाइम द्वारा खुला काट दिया जाता है जिसका उपयोग दाता डीएनए टुकड़े के अलगाव के लिए किया जाता है।दाता डीएनए टुकड़ा और प्लास्मिड वेक्टर का मिश्रण एक साथ मिलाया जाता है।डीएनए लिगेज की उपस्थिति में, डोनर डीएनए फ्रैगमेंट और प्लास्मिड वेक्टर का बेस पेयरिंग होता है।परिणामी डीएनए अणु दो डीएनए अणुओं - जीआई और वेक्टर का एक संकर है। आनुवंशिकी की शब्दावली में विभिन्न डीएनए स्ट्रैंड्स के इस इंटरमिक्सिंग को पुनर्संयोजन कहा जाता है।इसलिए, इस नए संकर डीएनए अणु को एक पुनः संयोजक डीएनए अणु भी कहा जाता है और प्रौद्योगिकी को पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी के रूप में जाना जाता है ।

ई. पुनः संयोजक वेक्टर का उपयुक्त मेजबान में परिवर्तन

पुनः संयोजक सदिश उपयुक्त परपोषी कोशिका में रूपांतरित हो जाता है, अधिकतर एक जीवाणु कोशिका।यह निम्नलिखित में से एक या दोनों कारणों से किया जाता है:जीआई की कई प्रतियां प्राप्त करने के लिए पुनः संयोजक डीएनए अणु को दोहराने के लिए।जीआई की अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए कि यह अपने आवश्यक प्रोटीन उत्पाद का उत्पादन करता है।कुछ बैक्टीरिया स्वाभाविक रूप से परिवर्तनीय होते हैं; वे पुनः संयोजक सदिश को स्वतः ग्रहण कर लेते हैं।

उदाहरण के लिए:  बैसिलस , हीमोफिलस , हेलिकोबैक्टर पाइलोरी , जो स्वाभाविक रूप से सक्षम हैं।

दूसरी ओर, कुछ अन्य जीवाणुओं को कृत्रिम तरीकों जैसे Ca ⁺⁺ आयन उपचार, विद्युतीकरण, आदि द्वारा शामिल करने की आवश्यकता होती है।

एफ. पुनः संयोजक कोशिकाओं का अलगाव

परिवर्तन प्रक्रिया रूपांतरित और गैर-रूपांतरित मेजबान कोशिकाओं की मिश्रित आबादी उत्पन्न करती है।चयन प्रक्रिया में केवल रूपांतरित मेजबान कोशिकाओं को फ़िल्टर करना शामिल है।गैर-पुनः संयोजक सेल से पुनः संयोजक सेल के अलगाव के लिए, प्लास्मिड वेक्टर के मार्कर जीन को नियोजित किया जाता है।उदाहरण के लिए, PBR322 प्लास्मिड वेक्टर में विभिन्न मार्कर जीन (एम्पीसिलीन प्रतिरोधी जीन और टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोधी जीन) होते हैं। जब pst1 RE का उपयोग किया जाता है तो यह प्लास्मिड से एम्पीसिलीन प्रतिरोधी जीन को बाहर निकाल देता है, ताकि पुनः संयोजक कोशिका एम्पीसिलीन के प्रति संवेदनशील हो जाए।

G. चयनित मेजबान कोशिकाओं का गुणन

एक बार रूपांतरित मेजबान कोशिकाओं को स्क्रीनिंग प्रक्रिया द्वारा अलग कर दिया जाता है; उन्हें बढ़ने और गुणा करने के लिए इष्टतम पैरामीटर प्रदान करने के लिए आवश्यक हो जाता है।इस चरण में रूपांतरित मेजबान कोशिकाओं को ताजा संस्कृति मीडिया में पेश किया जाता है।इस स्तर पर परपोषी कोशिकाएं अपने द्वारा किए गए पुनः संयोजक डीएनए की प्रतिकृति के साथ विभाजित और पुन: विभाजित होती हैं।यदि लक्ष्य जीआई की कई प्रतियां प्राप्त करना है, तो बस मेजबान सेल की प्रतिकृति की अनुमति है। लेकिन ब्याज का उत्पाद प्राप्त करने के लिए, अनुकूल परिस्थितियां प्रदान की जानी चाहिए ताकि वेक्टर में जीआई ब्याज के उत्पाद को व्यक्त करे।

एच। उत्पाद का अलगाव और शुद्धिकरण

अगले चरण में वेक्टर या इसके द्वारा एन्कोड किए गए प्रोटीन से जुड़े गुणा जीआई का अलगाव शामिल है।इसके बाद पृथक जीन प्रति/प्रोटीन का शुद्धिकरण किया जाता है।

जीन क्लोनिंग के अनुप्रयोग

एक विशेष जीन को अलग किया जा सकता है और उसका न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम निर्धारित किया जा सकता हैडीएनए के नियंत्रण अनुक्रमों की पहचान और विश्लेषण किया जा सकता हैप्रोटीन/एंजाइम/आरएनए फ़ंक्शन की जांच की जा सकती हैउत्परिवर्तन की पहचान की जा सकती है, उदाहरण के लिए विशिष्ट रोगों से संबंधित जीन दोष विशिष्ट उद्देश्यों के लिए जीवों को 'इंजीनियर' किया जा सकता है, जैसे इंसुलिन उत्पादन, कीट प्रतिरोध, आदि।